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CCK-8 实验怎么做，实验过程需要注意什么
1779 人阅读发布时间：2017-12-12 17:21
CCK 用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
CCK 操作说明：
一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2、按比例（例如：1/2 比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。
3、接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后加 CCK 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK 后的培养时间。）
二、细胞活性检测
1、在 96 孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养 24 小时（在 37℃,5% CO2 的条件下）。
2、向每孔加入 10 μL 的 CCK 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。
3、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。
4、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。
5、如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。
三、细胞增值-毒性检测
1、在 96 孔板中配置 100μL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24 小时（在 37℃，5% CO2 的条件下）。
2、向培养板加入 10μL 不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48 小时）。
4、向每孔加入 10μL CCK 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。
5、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。
6、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。
7、如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。 更多操作上的技术问题，随时欢迎与贝博生物 BestBio 交流讨论（www.beibokit.com）。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
备 注：
① 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK 试剂后的培养时间。
② 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入 CCK 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰 OD 值读数。
③ 白细胞可能需要培养较长时间。
④ 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK 溶液。
⑤ 如果没有 450nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450nm 滤光片的检测灵敏度最高。
⑥ 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
活 力计算：
细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和 CCK 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0 加药）：具有细胞、CCK 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力