细胞内 pH（Intracellular pH，pH_i）是酶活性和细胞功能的重要生理决定因素，所有蛋白质都依赖于严格调节的 pH 值以维持其结构和功能。质子 - 去质子化可以指示生物表面的电荷，并且是许多代谢反应中的组成部分。此外，跨线粒体膜的质子梯度用于产生细胞能量并支持其他线粒体过程。因此，细胞已经开发出多种机制来保持 pHi 的窄范围，以响应 pH 值的细胞内和细胞外波动。

我们采用 BBcellProbe^® P01 细胞内 pH 值荧光探针检测胞内 pH 值的变化。BBcellProbe^TM P01 是 pH 敏感的荧光染料，其在碱性条件下荧光强更高，反之酸性条件下变低，从而 BBcellProbe^TM P01 可被用于监测细胞内 pH 变化。

BBcellProbe^® P01 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BBcellProbe^TM P01 本身没有荧光，穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成荧光物质，从而被滞留在细胞内。产生的荧光物质最大激发波长为 502nm，最大发射波长为 528nm，其在不同的 pH 值条件下发射的荧光强度不同，从而可以反映细胞内 pH 值得变化情况。

BBcellProbe^® P01 主要用于哺乳动物细胞的研究，也可用于其他动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内 pH 水平检测。在有细胞内 pH 变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中也可应用。实际检测时推荐使用的激发波长为 488nm 左右，发射波长为 525～540nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内 pH 值的变化。

该方法主要用于细胞内 pH 值变化的定性检测。但是在一定 pH 值范围内荧光强度与细胞内 pH 有良好的线性关系，据此可以用特定的 pH 值的标准缓冲液制备标准曲线，从而可以换算出细胞内的 pH 值的具体数据。

但是由于不同细胞样本的膜厚度引起的荧光差异、不同细胞模型的蛋白组成差异导致的荧光光谱移动、荧光探针染色的均匀性差异、不同检测仪器的光漂白效应差异和仪器稳定性差异等因素的影响，标准曲线需要根据具体的细胞类型、检测仪器等的不同进行绘制，一般不能用别人现成的标准曲线。

标准曲线的绘制原理是利用Nigericin sodium salt破坏细胞Na+/H+ exchanger（NHE）泵，使细胞不能维持pH稳定性，以达到细胞内外pH值一致。
每个实验应单独校准pH值曲线，而不能使用别的经验曲线。
采用双波长法检测时，分别测量染料在大约490nm（pH依赖性）下激发时在535nm处的发射强度和当染料在大约440nm（非pH依赖性）的等位点激发时的发射强度。

标准曲线绘制：

1. 准备Hela细胞。
2. 用HBSS缓冲液洗涤细胞，然后用HBSS缓冲液重悬细胞。
3. 加入P01 pH探针置培养箱中避光孵育30分钟。
4. 离心移除HBSS缓冲液。
5. 加入含20uM Nigericin的 pH标准缓冲液静置5分钟。
6. 然后分别拍摄2张440nm和488nm发射波长535 nm的照片。
7. 用pH值5.5,6,6.5,7,7.5,8和8.5的标准缓冲液依次重复以上步骤。
8. 计算2个不同的荧光比值R值（F₄₈₈/F₄₄₀）。
9. 以R值（F₄₈₈/F₄₄₀）为纵坐标，pH_i为横坐标，绘制标准曲线。